科普：優化酶解條件，提升液質聯用檢測的肽段覆蓋率

在蛋白質組學研究中，液質聯用（LC-MS/MS）是鑒定和分析蛋白質的核心技術。其關鍵步驟是將大分子蛋白質酶解成適合質譜分析的肽段。酶解條件的優化，直接決定了肽段的質量、數量和代表性，是獲得高肽段覆蓋率（即被檢測到的肽段占理論可酶解肽段總數的比例）的關鍵環節。像廣州中森檢測這樣的專業機構，在提供蛋白質鑒定服務時，會非常注重酶解條件的精細優化。

為什么要優化酶解條件？

*提高肽段覆蓋率：覆蓋率越高，意味著蛋白質被“看得”越全面，更有利于準確鑒定蛋白質、發現翻譯后修飾（PTMs）、區分同源蛋白異構體。

*提高鑒定準確性和可靠性：充分、特異性的酶解能產生更多高質量肽段信號，減少假陽性和假陰性。

*改善質譜檢測效率：合適的肽段長度（通常6-25個氨基酸）和疏水性更利于色譜分離和離子化。

核心優化參數：

1.酶的選擇與組合：

*胰蛋白酶(Trypsin)：最常用，在賴氨酸(K)和精氨酸(R)后切割，產生C端帶正電荷的肽段，適合質譜分析。優化點在于其純度和活性。

*其他酶/組合：如Lys-C（僅在K后切）、Glu-C（在D/E后切）、Asp-N（在D前切）等。組合使用不同酶（如Trypsin/Lys-C）可減少漏切（如相鄰KR位點），顯著提高覆蓋率，尤其是對復雜樣品或特定區域。

2.酶與底物比例(E:SRatio)：

*比例過低，酶解不完全，導致漏切肽段多，覆蓋率低。

*比例過高，可能增加非特異性切割（酶切了不該切的位點），產生雜信號，甚至酶自身降解干擾。常用優化范圍在1:10到1:50(酶:蛋白,w/w)之間。

3.緩沖液條件：

*pH值：胰蛋白酶最適pH在7.5-8.5（常用50mM碳酸氫銨,pH~8）。pH偏離會影響酶活性和特異性。

*變性劑：尿素、鹽酸胍等可幫助溶解和變性蛋白質，暴露酶切位點。但高濃度（>2M尿素）或長時間高溫會氰酸化修飾氨基酸，需控制濃度、溫度和時間，并在酶解前稀釋或換液。

*還原劑與烷基化劑：這是關鍵步驟！

*還原：二硫蘇糖醇（DTT）或三(2-羧乙基)膦（TCEP）還原斷裂蛋白質中的二硫鍵（-S-S-），暴露更多酶切位點。

*烷基化：碘乙酰胺（IAA）或氯乙酰胺（CAA）烷基化還原產生的游離半胱氨酸（-SH），防止其重新形成二硫鍵，并穩定修飾狀態。優化還原/烷基化的濃度、溫度（室溫或37℃）和時間（通常30-60分鐘）至關重要，不充分會導致酶切效率低下。

4.溫度與時間：

*通常37℃孵育4-18小時（過夜常見）。時間過短酶解不充分；時間過長可能導致非特異性切割或肽段降解。溫度影響酶活性速率。

5.樣品復雜性：

*對于復雜混合物（如全細胞裂解液），可能需要更嚴格的變性條件或分步酶解策略。高豐度蛋白可能掩蓋低豐度蛋白信號，需結合分級分離。